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bmdm最新视觉报道_bmdm和pbmc(2024年12月全程跟踪)

内容来源：方新你好影院所属栏目：热点更新日期：2024-12-01

bmdm

大鼠原代巨噬细胞（BMDM）培养全攻略大家好！之前有朋友问我关于大鼠原代巨噬细胞（BMDM）的培养方法，今天终于有时间来分享一下我的经验啦！希望这些小建议能帮到那些和我一样曾经被这些小家伙们折腾得头大的同学们。首先，先说一下我的培养方法吧。我用的是M-CSF法，浓度大概在25-100ng/ml之间，这个区间都可以，浓度越高越好，当然也要看你的钱包厚度啦。血清浓度我用的是10%。选鼠和准备工作 𐟐튊我用的是4-8周的雄性SD大鼠，个人感觉4-5周的比较好用，质量上没啥太大差别，但数量上年龄大的会多一些。具体步骤如下：脱颈、摘腿、取骨：先把大鼠脱颈处死，然后摘掉腿，取出骨髓。剪两头、冲、过滤：把骨髓细胞剪成两段，用L-DMEM冲洗，200目过滤，离心重悬。培养和分离 𐟧ꊊ把骨髓细胞培养12-16小时后，取上清离心重悬，用含M-CSF的1640继续培养。这时剩下的贴壁细胞是间充质干细胞（MSC），如果不需要可以弃掉，需要的话可以用L-DMEM继续养。换液和保养 𐟌€ 第三天半换液（含M-CSF），第五天全换液（含M-CSF），第七天用PBS洗后换不含M-CSF的培养液。据说保养好的话，这些细胞最多可以活3周哦～常见问题解答 𐟤” 一只鼠能获得多少巨噬细胞？一只鼠可以获得一六孔板的量。 protocol严格吗？并不严格，除了最开始贴壁要足够，后续主要看因子浓度和细胞状态。贴得不多别着急换液，都贴了就没必要继续诱导了。有时候细胞急需用，我甚至会第四天全换液、第五天直接收。为什么我的BMDM会长角？这个问题真的困扰了我好久。后来发现长角不是状态不好，而是M2极化了。至少我后续诱导极化时获得的M2形态就是这些“长角M0”。避免这个问题有几种措施：换培养基：如果是H-DMEM，换成1640。贴壁步骤：这个步骤很重要，目的是分离出MSC，有大量研究表明MSC会促进巨噬细胞M2极化。这也是我建议用小鼠不用大鼠的原因，小鼠的MSC远没大鼠好活。先用rMSC喜欢的L-DMEM给人伺候贴舒服了，这时我们要的单核细胞全悬浮着，再取来诱导。检查M-CSF：我用的是国产某岸蛋白，分装冻-80后7个月效果就不好了。 PBS泡：试试PBS泡5-10分钟（适用于角没长很厉害的细胞）。小结 𐟓 接触这些细胞一年多，从啥都不会到用它毕业，对它们真是又爱又恨。总之希望能为科研界尽点微薄之力吧！祝大家顺利！

𐟧젍1/M2巨噬细胞摄取检测法 𐟔젦ƒ𓨦检测M1和M2型巨噬细胞对特定化合物的摄取量吗？这里有两种刺激方法供你参考！ 𐟒ꠥ﹤𚎍1型巨噬细胞，首先取培养好的BMDM细胞，用PBS清洗后，加入含LPS（200 ng/ml）的培养基刺激6小时。之后加入待测化合物和阳性药，作用半小时后，通过一系列操作，最后用LC-MS进样检测。 𐟌𑠥﹤𚎍2型巨噬细胞，步骤类似。先取细胞，用PBS清洗，然后加入含IL-4和IL-13（20 ng/ml）的培养基刺激24小时。之后同样加入待测化合物和阳性药，作用半小时，最后进行检测。 𐟓Œ 注意：IL-4和IL-13的配制需要先用灭菌水溶解，再用海藻糖稀释至所需浓度。现在，你可以根据这些方法，轻松检测M1和M2型巨噬细胞对化合物的摄取情况了！𐟎‰

BMDM提取及巨噬细胞分化全攻略 𐟐�‡†备工作：选择6-10周的小鼠，剪除下肢皮肤后，从髋关节和踝关节处剪断下肢，保持关节完整。将骨骼放入75%乙醇中消毒，但不要过久以免影响细胞活性。 𐟔ꠥ‰”除肌肉：在盛有PBS或培养基的培养皿中剔除肌肉，然后将骨骼放入新的培养基中。如果肌肉剃不干净，可以用纱布摩擦擦下肌肉。 𐟧𜠦𖈦𗥥…𗯼š在细胞房超净台中操作，准备镊子、眼科剪、酒精棉球、离心管、培养皿和T75细胞培养瓶。剪刀和镊子每次使用后要用棉球消毒。 𐟒‰ 骨髓冲洗：将消毒好的骨骼在酒精中浸泡30秒至1分钟，取出后用剪刀剪断骨头两端。用注射器抽取预冷的培养基，从一端冲出骨髓到培养皿中，多次冲洗至骨髓腔变白。 𐟔„ 离心分离：将骨髓冲洗液通过装有70um滤器的离心管研磨，400g/4℃离心5分钟，弃去液体。加入红细胞裂解液，振荡后400g/4℃离心10分钟，弃去液体。 𐟧젥Ÿ𙥅𛧻†胞：加入完全培养基和10ng/ml的M-CSF（peprotech），根据细胞贴壁情况调整培养时间，一般3-5天完全贴壁。如果贴壁慢的话，可以用2倍浓度的M-CSF。 𐟓… 铺板与换液：7天左右可以用胰酶消化或巴氏吸管刮下细胞铺板。个人习惯使用1640培基和ubi的血清，每3天全换液一次，一般不传代。以上是BMDM提取及诱导巨噬细胞分化的详细步骤，希望对大家有所帮助！

如何从小鼠中提取骨髓巨噬细胞BMDM 𐟐�𓨦„：8-14周大的小鼠都可以用来提取BMDM。一只小鼠的BMDM可以铺满一个10厘米的培养皿。如果你想要获得尽可能多的BMDM，可以考虑提取两只小鼠的前腿骨髓。 𐟔ꠦ�ꤥ悤𘋯𜚊小鼠处理：首先，用足量的75%乙醇对小鼠进行喷洒消毒，或者将其浸泡消毒。剪断腿部：用手术刀沿着小鼠大腿根部的髋关节处将整条腿拆下，注意不要切断腿骨。切断跟腱，切除胫骨周围的主要肌肉。用剪刀贴着股骨方向，切除股骨周围的主要肌肉。切除膝关节软组织，以获得股骨。切断腓骨及其周围肌肉，以暴露完整的胫骨。冲洗骨髓：将骨髓冲洗到细胞培养皿中，配好的DMEM（细胞培养处理，直径10厘米），每根骨头缓慢注射约2-3毫升DMEM，直至骨髓腔变白。确保DMEM不回流，以避免污染。培养基为DMEM+10%FBS+1%双抗+100 ng/mL M-CSF。 𐟧ꠦ取骨髓巨噬细胞BMDM需要一定的技巧和耐心，但通过以上步骤，你可以成功获得大量的BMDM细胞，用于科研实验。

𐟔解决P65磷酸化无条带难题！ 𐟤”你是否在WB实验中遇到了P65磷酸化无条带的困扰？别担心，这里有一些实用的血泪经验分享给你！ 𐟔짻†胞模型选择很重要 RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞是常用的炎症细胞模型，与NF和炎症密切相关。此外，BMM/BMDM、THP-1等人单核细胞白血病细胞也是不错的选择。 𐟒‰合适的刺激物是关键 LPS（脂多糖）是激活NF信号通路的有效刺激物，其次是TNF€IL-1퉧‚Ž性因子。这些刺激物能诱导巨噬细胞分化，进而激活P65磷酸化。 𐟒ᥢž加M1阳性对照为了确保刺激方式合适，可以增加一个M1促炎巨噬细胞阳性对照。这样，当结果出现异常时，可以迅速排查问题所在。 𐟓LPS刺激条件参考实验室常用的LPS浓度和刺激时间多种多样，但可以通过查阅文献来找到适合自己实验条件的最佳参数。 𐟒᥮ž验细节不容忽视在制样过程中，务必添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，并全程低温操作以保持磷酸化的稳定性。此外，封闭液和一抗稀释液的选择也至关重要。希望这些经验能助你顺利解决P65磷酸化无条带的问题！𐟎‰

巨噬细胞M1/M2极化实验详解巨噬细胞是一类位于外周血和炎症组织中的白细胞，属于免疫细胞中的单核细胞类群。它们主要通过吞噬细菌、死亡细胞或细胞残片来参与非特异性免疫调节。巨噬细胞将信号传递给其他淋巴细胞及其他免疫细胞，从而参与特异性免疫调节。巨噬细胞通常以单核细胞前体的形式进入血液中，当单核细胞浸润到组织中时，会分化成巨噬细胞。巨噬细胞主要存在于淋巴结、肺泡壁、骨髓、肝脏以及脾脏等组织中。根据功能以及炎症分泌水平，巨噬细胞分为M1型和M2型两种亚群。 M1巨噬细胞主要由LPS（脂多糖）及IFN𜈥𙲦‰𐧴 𜉦🀦𔻯𜌥ˆ†泌IFN-𜈥𙲦‰𐧴 𜉣€TNF-𜈨‚🧘䥝死因子𜉧퉤🃧‚Ž症因子。M2巨噬细胞主要由IL4（白细胞介素4）、IL13（白细胞介素13）、M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）等激活，主要分泌IL10（白细胞介素10）等抗炎症因子。巨噬细胞的鉴定方式主要有流式细胞术和免疫荧光实验，通过一些巨噬细胞标志物进行鉴定。常见的人和小鼠M1巨噬细胞标志物有CD68、CD80、CD86、CD32等；常见人和小鼠M2巨噬细胞标志物有CD206、CD204、CD163等。 M1和M2巨噬细胞的作用包括：①作为抗原提呈细胞；②杀伤肿瘤效应细胞；③通过释放溶解细胞酶直接杀伤肿瘤细胞；④处理和呈递肿瘤抗原，激活T细胞以产生特异性抗肿瘤细胞免疫应答；⑤通过特异性抗体介导ADCC效应杀伤肿瘤细胞；⑥分泌肿瘤坏死因子（TNF）等细胞毒性因子和产生超氧化代谢产物间接杀伤肿瘤细胞。在基础科学实验中，常用的细胞模型有小鼠RAW264.7巨噬细胞、人THP1单核细胞、小鼠BMDM骨髓细胞等。动物实验研究巨噬细胞的造模更多是偏向于炎症模型，例如急性肺损伤模型。 THP-1（人单核细胞） THP-1是来自急性单核细胞白血病患者血液分离而来，在基础科研实验中，常常诱导分化为巨噬细胞来进行机制研究。THP-1通常受PMA（佛波酯）150nmol/L诱导24h即可分化为巨噬细胞，然后在PMA持续存在的情况下，LPS（100ng/ml）、IFN𜈲0ng/ml）诱导48h，产生M1巨噬细胞；IL4（20ng/ml）、IL13（20ng/ml）诱导48h，产生M2巨噬细胞。 RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞） RAW264.7细胞是主要炎症模型、巨噬细胞极化等体外研究细胞，广泛用于急性肺损伤、风湿性关节炎等模型中。LPS（200ng/ml），12h可以诱导此细胞向M1分化，产生炎症因子，10ng/ml IL-4诱导RAW264.7细胞12h可以产生M2细胞。通过这些实验方法，可以更好地研究巨噬细胞的功能和作用，为免疫学和疾病治疗提供更多依据。

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