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载体构建最新视觉报道_载体构建的一般方法(2024年12月全程跟踪)

内容来源：方新你好影院所属栏目：热点更新日期：2024-12-01

载体构建

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载体构建攻略𐟔犰Ÿ”젨𝽤𝓦ž„建全流程目的基因的扩增首先，从NCBI上找到目的基因的核苷酸序列，利用Snapgene设计引物。通常在序列的前后各选20-25bp作为上下游引物。先用普通MIX进行退火温度优化，然后使用高保真酶（如诺维赞的2X Phanta⮠Max Master Mix）进行50uL体系的扩增。若需要高浓度，可扩增两管。连接连接目的基因与载体可选择T4连接酶，需在目的基因两端设计酶切位点和保护碱基（注意这些位点不能出现在片段内，以免片段被内部切开）。也可选择无缝克隆方式，利用同源重组原理，在引物5'端加入载体的同源臂，引物顺序为同源臂+酶切位点+基因引物。我个人偏爱这种方式，省时方便。本次使用的是诺维赞的ClonExpress⮠II One Step Cloning Kit连接酶，9个片段一次性连接成功。20uL的连接体系在37℃作用30 min，取10 uL用于转化。目的基因与载体的比例本次使用的载体是PcDNA3.1(5500bp)，基本50ng的载体就足够了。ClonExpress⮠II One Step Cloning Kit试剂盒推荐的载体和片段的摩尔比为1：2，例如片段500bp，浓度5ng/uL，载体5000bp，浓度25ng/uL。则片段摩尔数是载体的2倍，片段需要2㗵=10ng，即2uL。转化取10 uL连接产物转化DH5a。阳性克隆的筛选在1.5mL的EP管中加入800 uL的氨苄LB，用10uL的枪头把单个菌落全部占走，打入EP管中，震荡培养4h。一般选择8个克隆。4h后进行菌液PCR鉴定阳性克隆，选择2个送测序。注意事项移码问题：选择酶切位点时注意是否会引起目的基因的移码，可用Snapgene模拟。感受态：购买的商品化感受态可一支当两用，否则太浓不好挑选。自制的感受态在使用前需设置阳性对照，排除感受态质量问题。终止密码子和起始密码子：用于蛋白表达的目的基因需从ATG开始，以终止密码子结尾。 𐟔砦ž„建小贴士退火温度优化：对于高保真酶，退火温度至关重要，可通过梯度PCR找到最佳温度。引物设计：选择合适的引物长度和位置，确保扩增效率和特异性。连接效率：优化连接体系，确保目的基因与载体的高效连接。筛选策略：通过多个克隆的筛选，提高阳性克隆的比例。通过以上步骤，你可以顺利构建出含有目的基因的载体，为后续实验打下坚实基础。

启动子06-载体构建时如何选择启动子「汉恒生物」「科研」汉恒生物科技的微博视频

逆转录RNA的那些事儿：小技巧大智慧 𐟌€ 提取RNA之后，咱们得想办法把它变成稳定的cDNA，这样才能方便后续的基因表达检测、表达载体构建以及测序啥的。RNA这东西太脆弱了，稍微不注意就搞砸了，所以逆转录这一步特别关键。逆转录产品大比拼市面上逆转录的产品主要有两类。一类是经典的ABI HC RT KIT，兼容性好，量大价廉，但缺点是反应时间有点长。另一类是以Superscribe为代表的快酶，虽然操作麻烦点，需要预先加热破坏RNA的二级结构，但时间短，效率高。我的选择：ABI RT KIT 今天我用的是ABI RT KIT。每个反应需要2ug的总RNA。因为我要做qPCR，所以选择了random hexamer作为引物。如果你需要构建表达载体，那就得用oligo dT；如果想检测特定基因的存在和表达量，可以用gene specific primer。操作步骤准备RT Master Mix： 10x RT Buffer：2ul Rnase Inhibitor：1ul Reverse Transcriptase：1ul Random hexamer：2ul dNTP：0.8ul Rnase free H2O：3.2ul 准备RNA样本：用Rnase free H2O补足到10ul 小贴士所有操作都要在冰上进行！联排PCR管不好用的话，可以用图3的那种heat block放在冰上，金属导热能力强，温度基本接近冰的温度。操作RNA的基本原则：开始前换手套、桌面、移液枪，手套用RNase eliminate reagent充分擦拭（如果找不到，可以用异丙醇或者高浓度的异硫氰酸胍/SDS溶液），注意避免接触皮肤、口鼻、眼睛！用barrier tip。反应时间： 25度 10分钟 37度 120分钟 85度 5分钟 4度保存逆转录后的cDNA非常稳定，室温、4度、负20度保存都可以。我亲自试过，室温放一年的cDNA和genomic DNA在PCR水平上没啥显著变化。总结逆转录虽然听起来简单，但细节决定成败。希望这些小技巧能帮到你，让你的实验更顺利！𐟚€

如何获取目的基因：从文库到载体构建 𐟌 从基因文库中选择目的基因基因文库是一个巨大的数据库，里面包含了各种生物的基因信息。你可以从基因文库中找到你需要的特定基因。 𐟔젥Œ–学方法合成有时候，你也可以通过化学方法直接合成目的基因。这种方法虽然复杂，但可以确保基因的准确性。 𐟔„ 利用PCR技术扩增 PCR（聚合酶链式反应）是一种强大的分子生物学技术，可以用来扩增目的基因。通过这种方式，你可以获得大量的目的基因。 𐟛 ️ 构建基因表达载体在获取了目的基因后，你需要将其插入到一个表达载体中。这个过程包括用同种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，然后加入DNA连接酶，将它们连接起来。 𐟔젥𐆧›„基因导入受体细胞将构建好的重组DNA分子导入到受体细胞中是关键的一步。对于植物，可以使用农杆菌转化法、基因枪法或花粉管通道法；对于动物，显微注射法是常用的方法；而对于微生物，CaⲢ𚥏‚与的转化法效果更好。 𐟔 检测与鉴定目的基因检测目的基因是否成功导入受体细胞是必要的步骤。你可以通过检测受体细胞中是否具有标记基因来判断目的基因是否导入。此外，还可以根据受体细胞表现出的特定性状来鉴定目的基因是否成功表达。

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𐟧쨿‡表达载体构建全攻略✨ 想要深入了解基因过表达的操作流程吗？𐟤”这里为你揭秘过表达载体的构建过程！ 𐟒ᥟ𚥛 过表达，简单来说，就是将目的基因的CDS克隆到相应的质粒或病毒载体上，通过调控元件实现大量转录和翻译，从而达成过表达的效果。 𐟔在构建过表达质粒时，慢病毒载体是个不错的选择，因为它既支持瞬时转染也支持稳定转染，非常灵活！ 𐟒ꨴ觲’构建是第一步，也是至关重要的一步。如果你没有相关经验，别担心，可以找专业的公司来帮忙。当然，自己动手也是个不错的选择，只是需要一些耐心和技巧。 𐟔쨴觲’构建完成后，先进行扩增，然后在293T细胞中进行瞬时转染，验证质粒的准确性。 𐟤”瞬时转染和稳定转染并不是互斥的，而是根据实验需求来灵活选择的。有时候，你可以先用瞬时转染进行初步筛选或验证，再用稳定转染来获得长期稳定表达。 𐟒‰对于细胞功能实验，建议使用稳定转染，因为有些实验周期较长，如平板克隆和软琼脂克隆。而动物实验更是离不开稳定转染，以确保基因的长期表达。 𐟌Ÿ在构建稳定细胞株时，慢病毒是个高效率的选择。与脂质体转染相比，慢病毒转染效率更高，可以大大缩短筛选时间。 𐟒ᥦ‚果载体上有荧光标记，可以在荧光显微镜下观察转染效率。但请注意，有些荧光标记和目的基因是独立的启动子，所以最终判断过表达还是以蛋白水平为准哦！现在，你是不是对过表达载体的构建流程有了更清晰的认识呢？𐟘‰

𐟧즅⧗…毒载体构建全攻略𐟔슰Ÿ琦ƒ𓨦了解慢病毒载体的构建步骤吗？来，带你一起探索！ 𐟒‰慢病毒，这个逆转录病毒的小家伙，可是基因工程的好帮手。它像是个改造过的HIV，去掉了毒性基因，换上了我们想要的外源基因。这样，我们就能把基因稳稳地送到细胞里，让它们在细胞里好好表现一番啦！ 𐟔禞„建慢病毒载体，首先得有个好的表达载体和包装质粒。这些质粒里藏着病毒包装、转染、稳定整合所需要的所有秘密。把它们一起送到细胞里，病毒就能开始它的表演啦！ 𐟒᥌…装好的病毒颗粒会分泌到培养基里，我们离心取得上清液，就可以直接用来感染宿主细胞啦！是不是很方便呢？ 𐟒ꦅ⧗…毒的优势可不止这些哦！它能整合到宿主基因组里，让细胞长时间稳定表达外源基因。而且，它还能感染分裂期和非分裂期的细胞，低免疫原性，直接注射活体组织也不易造成免疫反应。这些特点让它在动物实验中大放异彩！ 𐟎‰现在，你是不是对慢病毒载体的构建步骤有了更深入的了解呢？快来试试吧！